PB1-F2 et réponse de l'hôte
Travail réalisé par :
Aurore Vidy-Roche, Olivier Leymarie et Ronan Le Goffic
La protéine PB1-F2 du virus influenza est une petite protéine non-structurale décrite en 20011. Elle est issue d’un cadre alternatif de lecture de 273 nucléotides situé sur le segment 2 codant également la protéine PB1. Les premiers travaux réalisés sur PB1-F2 démontrent qu’elle possède des vertus pro-apoptotiques et un tropisme mitochondrial. De plus, PB1-F2 semble impliquée dans la virulence des souches de virus qui l’expriment en agissant sur le système immunitaire, et notamment en amplifiant l’apoptose de macrophages alvéolaires infectés, compromettant ainsi les chances de mobiliser efficacement les acteurs de l’immunité adaptative.
Bibliographie traitant de PB1-F2. Travail in vitro
Étude des fonctions de PB1-F2 sur cellules épithéliales respiratoires humaine A549
Les résultats de ce travail ont été publiés en 2010 dans Journal of Immunology : J Immunol. 2010;185(8):4812-23.
Afin d’étudier la contribution de PB1-F2 dans la réponse innée des cellules épithéliales respiratoires qui constituent les principales cibles du virus influenza, nous avons entrepris de caractériser le transcriptome associé à l’expression de PB1-F2 au cours de l’infection virale. Pour ce faire, nous avons construit un mutant par génétique inverse (ΔF2, cf: production du virus ΔF2) incapable d’exprimer PB1-F2 pour comparer l’expression des gènes induits par le virus WSN et son mutant ΔF2 sur des lignées de cellules alvéolaires de poumon humain.
Nous avons identifié, sur un total de 41000 gènes analysés, 616 gènes dont l’expression diffère entre les cellules infectées par le virus parental ou son mutant. L’analyse ontologique des données obtenues a révélé que PB1-F2 est impliquée dans deux processus majeurs de l’immunité : l’inflammation et la présentation de l’antigène. L’expression de PB1-F2 exacerbe l’expression des gènes impliqués dans ces deux fonctions.
A l’aide de l’application ‘Ingenuity’2, nous avons pu comparer la régulation des gènes spécifiquement induits ou réprimés par PB1-F2 et identifier les voies de signalisation engagées dans ces processus. Les voies de signalisation de type interféron apparaissent comme les éléments majeurs impliqués dans la régulation des gènes identifiés comme spécifiquement induits par PB1-F2. Nous avons vérifié par PCR quantitative les niveaux d’expression de l’interféron-ß (IFN-ß). L’analyse comparative des cinétiques de production d’IFN-ß dans les différentes conditions d’infection confirme que PB1-F2 exacerbe l’expression de cette cytokine. Ces résultats placent donc PB1-F2 comme un élément antagoniste de la protéine NS1. En effet, la fonction principale de NS1 est d’inhiber la synthèse d’interférons afin d’empêcher la mise en place d’une défense antivirale efficace par la cellule hôte. Nous avons donc cherché à caractériser l’effet de PB1-F2 dans un système d’infection dépourvu de NS1 en employant des virus mutants ΔNS1 et doublement mutants ΔNS1-ΔF2. Il apparaît que le virus ΔNS1 induit beaucoup plus d’IFN-ß que le virus ΔNS1-ΔF2 (3300 vs 400 fois). Ces mesures confirment la contribution importante de PB1-F2 dans l’induction d’IFN-ß au cours de l’infection virale et placent NS1 et PB1-F2 dans des rôles antagonistes. L’effet inhibiteur de NS1 semble toutefois prendre le pas sur l’effet inducteur de PB1-F2. Enfin, afin de vérifier que la réponse de l’hôte à PB1-F2 ne soit pas spécifique au virus WSN/33, nous avons contrôlé l’activité de plusieurs PB1-F2 issues de souches différentes (H1N1, H3N2, H5N1 et H6N2) sur la production d’IFN-ß. Pour ce faire, des cellules ont été transfectées par des plasmides exprimant différents variants de PB1-F2 puis infectées ou non par un virus n’exprimant pas PB1-F2. Nos résultats montrent que dans les cellules infectées, l’induction d’un grand nombre de variants de PB1-F2, mais pas de l’ensemble des variants, exacerbe la production d’IFN-ß. En revanche, l’expression de PB1-F2 hors d’un contexte infectieux s’avère incapable d’exacerber la production d’IFN-ß. Ceci confirme donc que l’action de PB1-F2 n’est pas restreinte à un seul génotype de virus influenza. En résumé, PB1-F2 a un impact transcriptionnel sur la cellule hôte infectée qui est essentiellement axé sur la production d’IFN-ß. Ceci a pour conséquence une meilleure expression de gènes impliqués dans la présentation de l’antigène et pourrait s’inscrire dans une stratégie d’échappement du virus au système immunitaire. En effet, il a été démontré que des peptides issus de PB1-F2 sont présentés par le CMH-I mais que les lymphocytes CD8+ spécifiques de ces peptides sont très peu cytolitiques. PB1-F2 pourrait ainsi fonctionner comme un leurre du système immunitaire adaptatif antiviral.
Transcriptome PB1-F2 Visualisation du transcriptome spécifique de PB1-F2 au cours d'une infection virale.
L'ensemble des gènes exprimé par les cellules A549 est représenté : en ordonnée se trouvent les facteurs d'induction (en Log base 2) au cours d'une infection de 24h par le virus sauvage (WSN), et en abcisse les facteurs d'induction au cours d'une infection par le virus dépourvu de PB1-F2. Les facteurs d'induction sont calculés à par rapport aux cellules non infectées. Chaque spot correspond à aux niveaux d'expression d'un gène. Un spot qui s'éloigne de la médiane se comporte différemment entre les deux conditions expérimentales.
Voies de signalisation activées par PB1-F2
Comparaison des gènes induits au cours de l'infection par les virus sauvage et mutant.
Les gènes régulés au cours des différentes infections virales ont été regroupés dans un diagramme de Ven. 616 gènes ont leur régulation influencée par la présence de PB1-F2. Parmis ces 616 gènes, 508 sont régulés lorsque PB1-F2 est exprimée au cours de l'infection. Les fonctions associées à ces gènes sont :
PB1-F2 & pathogénicité
Au cours de l'infection par le virus influenza, PB1-F2 est adressée aux mitochondries où elle induit l'apoptose. Des expériences en modèle souris ont montré l'implication de PB1-F2 dans la létalité du virus. La comparaison des pouvoirs pathogènes du virus A/PR8/34 et de son mutant respectif dépourvu de PB1-F2 a pu mettre en évidence que PB1-F2 favorise l'inflammation liée à l'infection virale ainsi que la fréquence et la sévérité de pneumonies bactériennes secondaires3. L'acide aminé situé en position 66 de cette protéine semble être un élément déterminant dans ces phénomènes. On retrouve en cette position une sérine dans les séquences de virus dont la virulence est importante : grippe de 1918 H1N1, isolats H5N1 aviaires (Hong Kong - 1997), souches pandémiques de 1957 (H2N2) et de 1968 (H3N2). Les isolats grippaux moins pathogènes possèdent une asparagine à cette position. La production par génétique inverse de deux virus recombinants dont la seule différence est un changement de l'asparagine 66 en sérine sur le segment codant PB1-F2 met en évidence une plus grande pathogénicité du virus Ser66.
Qu'en est-il du virus Influenza A/Mexico/2009 (H1N1)?
Connaissant le pouvoir pathogène associé à PB1-F2, on peut se demander ce qu'il en est de la souche pandémique de 2009. L'examen des séquences des différents isolats du virus de grippe "porcine" a révélé que ce virus n'exprime pas de PB1-F2 ou simplement une forme tronquée. En effet, un codon stop est présent en position 12 (cf shéma ci dessous).
 Il est intéressant de constater qu'en dépit de son caractère extrèmement contagieux, le virus Influenza A/Mexico/2009 (H1N1) possède une pathogénicité modérée. L'absence de PB1-F2 est donc très probablement impliquée dans cette faible virulence.
Travail in vivo
Afin d’évaluer in vivo l’impact de PB1-F2 au cours d’une épreuve virale, nous avons comparé les effets d’un virus mutant incapable d’exprimer cette protéine (ΔF2), avec ceux provoqués par le virus sauvage sur des souris C57Bl/6. Les mortalités générées par les deux virus ont révélé des différences de virulence, ainsi la LD50 du virus sauvage est de 1,5.105 PFU alors que celle du virus ΔF2 est de 3.105PFU. Ces différences se traduisent également par une morbidité nettement moins marquée lorsque les souris sont infectées à faible dose (5.104 PFU/souris) : 17% de perte de poids 3 jours post-infection pour les souris infectées par le virus sauvage contre seulement 6% pour les souris infectées par le mutant ΔF2. Les courbes de survie de souris infectées avec un inoculum de 2,5.105PFU permettent de clairement mettre en évidence les différences de virulence des deux virus.
L’analyse transcriptomique des poumons issus des animaux infectés a permis de définir la contribution de PB1-F2 dans la pathologie associée au virus. Les résultats découlant de cette analyse permettent d’associer une fonction inflammatoire à PB1-F2. En effet, les souris infectées par le virus ΔF2 développent une inflammation modérée en comparaison des souris infectées par le virus exprimant PB1-F2. A l’aide d’outils ontologiques, nous avons pu identifier un réseau de gènes particulièrement sensible à l’expression de PB1-F2 au cours de l’infection. Les fonctions associées à ce groupe de gènes sont impliquées dans la réponse inflammatoire, la mort cellulaire et le recrutement de cellules immunitaires. Deux éléments centraux se détachent du réseau de gènes identifié : les éléments du complexe de transcription NF-kB et les interférons. Une fois activés, ces deux éléments vont induire les autres gènes du réseau, parmi lesquels se trouvent de nombreuses chimiokines, des cytokines pro-inflammatoires, des protéases de type cathepsine, et des gènes pro-apoptotiques. Suite à cette analyse transcriptomique, nous avons cherché à confirmer les fonctions associées à PB1-F2. Pour cela nous avons comparé l’intensité de la réaction inflammatoire viro-induite par bioluminescence in vivo. Ceci a été réalisé en employant un vecteur adénovirus capable de transduire la construction NF-kB-luciférase au sein de poumons de souris Balb/c. La bioluminescence induite par le virus ΔF2 se trouve plus modérée dans les temps d’infection précoce, confirmant l’implication de PB1-F2 dans l’exacerbation de l’activation de NF-kB. Nous avons également réalisé des dosages de médiateurs pro-inflammatoires par dosage ELISA et par qRT-PCR. Ces analyses on confirmé une sécrétion moindre de cytokines pro-inflammatoires dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA) de souris infectées par le virus ΔF2. A titre d’exemple la production de TNF-α s’élève à 530 ± 35 pg/ml de LBA lors de l’infection par le virus sauvage contre 329 ± 91 pg/ml pour les souris infectées par le virus ΔF2. Enfin, la quantification des leucocytes recrutés au niveau des voies aériennes respiratoires a révélé un recrutement plus grand de leucocytes, essentiellement les polynucléaires neutrophiles, au niveau des voies aériennes respiratoires des animaux infectés par le virus sauvage exprimant PB1-F2 (40% de différence entre les deux groupes d’animaux). En conclusion, nos résultats suggèrent fortement l’implication de PB1-F2 dans l’inflammation aigue provoquée par les virus grippaux. L’expression de PB1-F2 exacerbe l’activation du facteur de transcription NF-kB qui va déclencher une plus grande production de médiateurs de l’inflammation et, en conséquence, un recrutement plus massif de leucocytes au sein des poumons. Bibliographie :
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